БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ


БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

Бактериальная биолюминесценция обладает высокой чувствительностью к действию различных ингибиторов биологической активности: анестетиков, наркотиков, промышленных ядов, инсектицидов, пестицидов, отравляющих и лекарственных веществ. Отсутствие специфичности делает перспективным применение светящихся бактерий в экологическом мониторинге, где по воздействию на живые бактерии определяется токсичность суммы вредных веществ. Простота измерения люминесценции, экспрессность метода (время анализа 1-3 мин), высокая чувствительность (для различных классов соединений от 10-3 до 10-12М), возможность автоматизации измерений и статистической обработки данных обеспечивает светящимся бактериям несомненное преимущество по сравнению с другими биологическими тестами.

Имеющиеся интегральные биотесты с использованием живых организмов (парамеций, водорослей, дафний, рыб и т.д.) имеют ряд недостатков (трудоемкость, плохая воспроизводимость результатов, длительность анализа, трудности количественной оценки). Биотесты на светящихся бактериях дают количественную меру токсичности и часто превосходят известные биотесты по быстродействию, точности, чувствительности и простоте, позволяют контролировать одновременно значительное число токсикантов. Природные морские и наземные светящиеся бактерии, а также трансгенные штаммы микроорганизмов с клонированными в них lux-генами используются при изготовлении биолюминесцентных биотестов для оценки загрязнения природных водных источников, промышленных стоков и почв В основе этих методов лежит изменение интенсивности люминесценции биопрепаратов после воздействия того или иного анализируемого вещества. Концентрацию анализируемого вещества определяют, измеряя параметры излучения. Исходя из современных требований, предъявляемых к оценке токсичности веществ биолюминесцентным способом, можно определить общепризнанные в токсикологии параметры. Такими параметрами являются: эффективная концентрация (ЭК50) - концентрация вещества, которая подавляет функцию люминесценции на 50%, и пороговая концентрация (ЛК0) или уровень биологически безопасного разведения (УББР) - концентрация (разведение) исследуемого вещества, при достижении которой уровень свечения исследуемых растворов равен интенсивности свечения в контрольных кюветах. Светящиеся бактерии из коллекции культур ИБСО были успешно использованы для создания тест-систем на различные фенолы и их производные, сульфопроизводные янтарной кислоты и гексахлоранциклогексана (ГХЦГ). Параллельно с использованием в биолюминесцентном анализе люминесцентных бактерий ведется разработка новых направлений биотестирования. Одним из них является использование в качестве тест-объекта люминесцентных рекомбинантных штаммов различных микроорганизмов (E.coli, Pseudomonas, Salmonella, etc.), что позволяет упростить процедуру измерений и использовать биолюминесцентные биотесты для определения генотоксичности в медицине, экологическом мониторинге, биотехнологии, для оценки качества продукции пищевой промышленности и т.д.

Создаются и используются рекомбинантные биолюминесцентные штаммы для определения различных антибиотиков, тяжелых металлов. Использование рекомбинантных штаммов Е.соli с клонированным геном люциферазы оказалось эффективным при разработке биопрепарата для тестирования с помощью методов биолюминесцентного анализа пресных вод. Получены репортерные штаммы, обладающие высокой специфичностью к определенному токсическому агенту. Имеется ряд сообщений о создании биолюминесцентных репортеров для определения тяжелых металлов и фенолов в водных и почвенных образцах. Гены lux-оперонов, клонированные в несветящихся микроорганизмах, хорошо зарекомендовали себя в качестве модельных систем для изучения последствий случайной или целенаправленной интродукции трансгенных микроорганизмов в окружающую среду. Результаты мониторинга ТМ по биолюминесцентному сигналу подтверждаются более сложными методами молекулярной биологии. Другим направлением является исследование возможности использования клонированных lux-оперонов или их фрагментов для прогнозирования стабильности экспрессии чужеродных генов в различных условиях существования организма-хозяина. Такие маркерные системы созданы для большого количества микроорганизмов, а также для высших организмов и растений.

Биолюминесцентные биотесты Microtox, ToxAlert, LUMIStox на основе светящихся бактерий производятся несколькими зарубежными фирмами. Наибольшее применение за рубежом нашел биотест Microtox, который первым был разработан и широко используется в лабораторных и полевых исследованиях для контроля качества промышленных и природных вод, определения степени токсичности вновь создаваемых химических соединений и фармацевтических препаратов.

В России биолюминесцентные биотесты «Микробиосенсор В17-677F» (на основе светящихся лиофилизированных бактерий P.phosphoreum, 1983г.) и «Микробиосенсор ЕСК» (на основе генетически модифицированного штамма E.coli Z905, несущего плазмиду PHL1 с lux-геном из P.leiognathi) разработаны в Институте биофизики СО РАН А.М.Кузнецовым (Kuznetsov et al., 1990; Кузнецов и др., 1996, 2000), Они используются в лабораторных и полевых исследованиях для контроля качества промышленных и природных вод (Кузнецов и др., 2000; Kuznetsov et al., 1998, 1999, 2002) определения степени токсичности химических соединений и фармацевтических препаратов (Кратасюк и др., 1994; Попова и др., 1991, 1994). Биотесты “Микробиосенсор” являются стандартными тест-объектами для измерения интегральной токсичности исследуемых водных образцов, исключают необходимость культивирования и поддержания бактериальных культур с маркерным lux-геном. Кроме красноярских биолюминесцентных биотестов в России имеются разработанный в МГУ «Эколюм» (на основе светящихся лиофилизированных бактерий V.fischeri и генетически модифицированного штамма E.coli, 2003г) и в ИЭГМ УрО РАН микробиолюминесцентный индикатор токсичности (МИТ), (на основе генетически модифицированного штамма E.coli, Пшеничнов и др., 2005г.). По простоте и числу анализируемых веществ биолюминесцентные тесты сходны со спектрофотометрическими, но по чувствительности превосходят их на два-три порядка и отличаются простотой и экспрессностью.

В качестве тест-объектов вместо светящихся бактерий можно использовать также реакции, катализируемые люциферазой, биферментной системой: НАДН:ФМН-оксидоредуктаза – люцифераза. Тесты на основе многозвенных цепей сопряжения ферментов с люциферазами позволили значительно расширить круг веществ, анализируемых биолюминесцентным методом и включить в него соединения, не принимающие непосредственного участия в биолюминесценции. Использование ферментативных реакций в качестве индикаторных систем реакции антиген - антитело привело к созданию различных вариантов гомогенных и гетерогенных иммуноферментных методов, в которых в качестве ферментов - маркеров наряду с пероксидазой хрена и щелочной фосфатазой используются люциферазы. Иммунобиолюминесцентные методы решают проблему избирательного анализа для веществ, не участвующих прямо или опосредованно в процессе биолюминесценции - ксенобиотиков, ингибиторов биологической активности и токсикантов. В иммуноферментном биолюминесцентном анализе апробированы люциферазы почти всех светящихся организмов, причем наибольшей популярностью пользуется биолюминесцентная система светляков. Биолюминесцентный анализ используется в гистохимии для получения трехмерной картины распределения метаболитов в срезах тканей мозга, в "аутолюмографии" для определения локализации ферментов на фотопленку в полиак¬риламидном геле при электрофорезе и изоэлектрофокусировании. В последнее время для контроля популяций насекомых в сельском хозяйстве используют в качестве приманок их феромоны.

На основе ферментов люминесцентной реакции: люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в Институте биофизики СО РАН под руководством снс Н.А.Тюльковой производятся комплекты реактивов для биолюминесцентного анализа (КРАБы). Комплект реактивов для аналитической биолюминесценции (КРАБ) используется как многокомпонентный реагент, иммобилизованный в крахмальном геле, разработаны методы определения активности NAD-зависимых дегидрогеназ - лактатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, протеаз и антипротеаз в плазме и сыворотке крови, биопсийном материале, платиноидов, и т.д. На основе КРАБа и гидрогеназы водородных бактерий разработаны методы определения активности гидрогеназы и концентрации растворенного водорода. Отличительной особенностью ферментативных биотестов по сравнению, с биотестами, выполненными на живых организмах, является возможность варьирования их чувствительностью, изменяя условия проведения анализа, а именно состав реакционной смеси (количество ферментов и субстратов, объем добавляемой токсической смеси) и последовательность добавления компонентов реакции (использование прямой или обратной ADH-реакции и т.д.). В экологических исследованиях биолюминесцентные тесты in vivo и in vitro взаимодополняют друг друга. Совместное использование биотестов позволяет расширить круг анализируемых токсикантов. В люциферазных биотестах действие токсических веществ происходит непосредственно на люциферазу - ключевой фермент метаболизма светящихся бактерий. В случае светящихся бактерий прямое влияние токсикантов на люциферазу ограничено клеточной стенкой и мембраной бактерий, препятствующих свободному проникновению любых посторонних веществ в клетки, однако происходит влияние на другие важные процессы жизнедеятельности клетки, так или иначе связанные с биолюминесценцией, например, дыхание. Совместное использование биолюминесцентных биотестов in vivo и in vitro позволяет получать разностороннюю информацию о механизмах воздействия токсических веществ. Использование нескольких биотестов одновременно гарантирует полное обследование водоемов и водозаборов на токсичность независимо от структуры и физико-химических свойств токсикантов, токсичных как для целого организма, так и для клеток и ферментов. При этом в присутствии токсических веществ свечение может как уменьшаться, так и увеличиваться. Показателем наличия в среде токсичности служит изменение интенсивности исследуемого образца в сравнении со свечением в контроле.

Литература:

Чумакова Р.И., Гительзон И.И. Светящиеся бактерии М: Наука, 1975

Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е. и др. Светящиеся бактерии. Новосибирск: Наука, 1984. 275 с.

Кузнецов и др., 1996

Родичева Э.К., Выдрякова Г.А., Медведева С.Е. Каталог культур светящихся бактерий, Новосибирск: Наука, 1997

Родичева Э.К., Медведева С.Е., Выдрякова Г.А., Чугаева Ю.В., Кузнецов А.М. Сохранение генофонда и перспективы использования специализированной коллекции светящихся бактерий института биофизики СО РАН. //Прикладная биохим. и микробиол. 1998. Т.34, №1. С.75-82.

Kuznetsov A.M., Rodicheva E.K., Medvedeva S.E. Analysis of river water by bioluminescent biotests. //Luminescence. 1999. V.14. N5, P.263-265

Родичева Э.К., Кузнецов А.М., Медведева С.Е. Вестник ОГУ, 2004

2006 ©  Bioluminescence and luminous organisms
http://bl.ibp.ru/