Welcome _ANONYMOUS!
Time: 14:36
Пятница, 18 августа 2017 г.
Главное Меню
· Главная
· Лаборатории
· Наши разработки
· БД "BioLumbase" природные
· БД "BioLumbase" трансгенные
· Каталог штаммов
· Публикации

· Контактная информация

· FAQ
· Web-ссылки

Биолюминесценция
· Основы биолюмиинесценции
· Биолюминесценция в науке
· Биолюминесценция в образовании
· Прикладная биолюминесценция

Now on-line
Сейчас, 9 гостей и 0 посетителей онлайн..

Вы анонимный пользователь.


Language of interface
Выберите язык интерфейса:


Log in
 





Регистрация


 

Белки, которые потрясли мир
.: Дата публикации 09-Фев-2007 :: Просмотров: 857 :: Печатать текущую страницу :: Печатать все страницы:.

Белки, которые потрясли мир

Ю.А. Лабас, А.В. Гордеева, А.Ф. Фрадков

Юлий Александрович Лабас, кандидат биологических наук,
ведущий научный сотрудник Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Анна Викторовна Гордеева, аспирантка того же института.

Аркадий Федорович Фрадков, кандидат химических наук, старший научный сотрудник
Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Как все начиналось?

Эта история началась 4 января 1761 г. По приказу короля датский военный корабль вез из Копенгагена в Смирну научную экспедицию. Одним из участников был зоолог Форскол. Однажды в начале марта, когда корабль плыл по Северному морю, пассажиры заметили в воде странное свечение. Причиной оказались небольшие, с крупную монету величиной, медузы, «способные светиться внутри». Форскол выловил несколько таких медуз и поместил их в ведро. Если медуз тревожили, они ярко светились зеленым фосфорическим светом. Форскол заспиртовал несколько экземпляров медуз и записал по-латыни в своем походном дневнике: «при раздражении и гибели светятся». С этой записи началась история исследований эквореи, как позже назвали этот род медуз (от лат. aqua – вода).

В изданной посмертно монографии Форскола «Fauna arabica» (1775) открытая им светящаяся медуза называется Medusa aequorea. Однако позже эту медузу назвали по имени первооткрывателя.

Оказалось, что у медузы имеется светящееся вещество. Через полтора века выяснилось: для предварительной “заправки” эквореи таким веществом абсолютно необходим кислород. Само же оно представляет собой целентеразин (от лат. Coelenterata - кишечнополостные) - имидазолпиразиновое производное. Целентеразин окисляется молекулярным кислородом до гидроперекиси в момент присоединения к экворину, белку, способному связывать ионы кальция.

Молекулярная масса экворина 27 кДа. Сейчас его широко используют для определения концентрации внутриклеточного кальция. Еще более популярным в биологических исследованиях стал другой белок, так называемый зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescent potein – GFP), впервые выделенный также из эквореи, но из другого ее вида – Aequorea victoria. Разговор далее пойдет о блестящей научной карьере этих и близких к ним белков. Однако вначале необходимо объяснить роль таких белков в жизнедеятельности морских животных, т.е. зачем и почему они светятся.

Что такое биолюминесценция?

Биолюминесценцией называют свечение живых организмов, хорошо видимое в темноте. В настоящее время известно более тысячи биолюминесцентных видов. Это бактерии, динофлагелляты, радиолярии, грибы и подвижные многоклеточные животные разных типов – от беспозвоночных до рыб.

Подавляющее большинство светящихся существ – обитатели морских глубин, но есть среди них и наземные (отдельные виды грибов, земляных червей, улиток, многоножек и насекомых). Пресноводных биолюминесцентных видов по не выясненным пока причинам практически нет, кроме одной новозеландской улитки и нескольких видов бактерий.

Колонии бактерий, высшие грибы и некоторые другие живые существа светятся непрерывно (статически). Такой свет привлекает животных, что способствует попаданию бактерий в нового хозяина и распространению спор грибов. Однако громадное большинство биолюминесцентных организмов, включая медузу экворею, генерируют короткие (0,1–1,0 с) световые вспышки в ответ на внешние раздражения. Такие вспышки чаще всего предназначаются для отпугивания хищников, а также других быстро движущихся животных, способных механически повредить субтильный светящийся организм (медузу, гребневика и т.п.) при случайном столкновении. В других случаях свет используют для внутривидовой коммуникации, в том числе (например, у светляков) – как сигнал, привлекающий особи другого пола. У некоторых глубоководных рыб надо ртом имеется подвижный отросток – «удилище», а на нем – световая приманка для жертвы. Другие рыбы используют свои светящиеся органы для освещения ближнего пространства и т.д.

Всего насчитывается больше 30 различных биохимических вариантов биолюминесценции, независимо возникших в ходе эволюции у различных организмов.

Как появились биолюминесцентные системы?

Еще Ч. Дарвин отметил, что происхождение биолюминесценции непросто объяснить теорией естественного отбора. Полезный эффект свечения всецело связан со зрительным восприятием животных; следовательно, оно должно быть хорошо заметным. Кроме того, если возникают световые вспышки, то они должны с момента своего появления быть приурочены ко вполне определенным поведенческим ситуациям, например, сопровождать двигательную реакцию, вызванную приближением хищника. Иначе от свечения никакой пользы не будет. Здесь нет места постепенному переходу за счет отбора от сверхслабого свечения, свойственного всему живому, но выявляемого только приборными методами, к более яркому. Ведь ниже порога видимости не будет никакого отбора.

Следовательно, у некоторых несветящихся видов время от времени должны случайно возникать мутанты, ярко светящиеся непрерывно или при каких-то вполне определенных обстоятельствах, например, при испуге (что повышает шансы на выживание). Только так может начаться процесс естественного отбора, приводящего к дальнейшему усовершенствованию биолюминесцентной системы.

Заметим в этой связи, что у многоклеточных животных обычно излучает свет не все тело, а только определенный тип клеток, так называемые фотоциты, сгруппированные обычно в специализированные органы свечения – фотофоры, которые у некоторых рыб и кальмаров устроены очень сложно. В ряде случаев эти органы светятся непрерывно из-за обитающих в них симбиотических светящихся бактерий. В прочих случаях свечение импульсное. Оно бывает внутриклеточным или секреторного типа. Последнее возникает при смешении выбрасываемых из организма веществ, покрывающих его светящейся слизью или образующих в воде «световое облако».

Субстраты – люциферины и ферменты – люциферазы

Еще в 1885 г. французский ученый Дюбуа показал, что в биолюминесцентной реакции участвуют термостойкий субстрат, люциферин, и разрушающийся при нагревании фермент люцифераза.

Если экстрагировать из биолюминесцентного организма светящееся вещество и разделить его раствор на две части, одну нагреть до 60–100°С, а затем обе части снова слить, то смесь растворов будет светиться в присутствии кислорода.

У разных организмов субстраты и ферменты, ответственные за биолюминесценцию, совершенно разные. Названия их чисто условные. В дальнейшем оказалось, что у некоторых светящихся организмов за свечение ответственны стойкие люциферин-люциферазные комплексы – фотопротеины. В таких комплексах люциферин временно или постоянно слит в одно целое с люциферазой.

Роль кислорода и антиоксидантное происхождение биолюминесцентных систем

Что же служит непосредственной причиной свечения?

Для свечения всегда необходим молекулярный (О2) или атомарный кислород. У атома кислорода имеются несколько нестабильных возбужденных состояний. Переход атомов из возбужденного в устойчивое состояние сопровождается испусканием инфракрасных фотонов. Свечение же организмов обычно синее или зеленое. Это достигается суммированием энергий одновременного перехода из возбужденного состояния в основное двух или более атомов кислорода при одновременном разрыве -О–О- и С–С-связей в так называемой диоксетановой перекиси. Диоксетановая перекись – нестойкое соединение. Она образуется и тут же распадается в процессе окисления субстрата – люциферина молекулярным кислородом или так называемыми активными формами кислорода (АФК).

АФК – это анион с одним электроном на внешней орбите (супероксид), перекись водорода, уже упомянутый синглетный кислород, крайне агрессивный окислитель - гидроксил-радикал и др. Они играют громадную роль в жизни организмов. Это «полуфабрикат» и «брак» дыхательных процессов, в которых нормальный конечный продукт – восстановленный кислород с четырьмя электронами на внешней орбите в составе молекулы воды. Опасность АФК обусловлена их высокой способностью окислять «что попало» в живом организме: ДНК и РНК, белки и жиры и т.д.

Для защиты от АФК организмы вынуждены постоянно потреблять и синтезировать разнообразные вещества - антиоксиданты (витамины С и Е, каротиноиды и т.п.) и ферменты, из которых главные – супероксиддисмутаза (преобразователь супероксида в перекись водорода) и каталаза (преобразует перекись водорода в воду).

Однако в умеренных количествах АФК необходимы для жизнедеятельности и образуются посредством специальных ферментов (НАДФН-оксидазы и др.) АФК секретируются белыми кровяными тельцами для уничтожения микробов. Кроме того, они участвуют в регуляции клеточного деления, в запуске «запрограммированной смерти» клеток – апоптоза, в управлении тонусом кровеносных сосудов и во многих других жизненно важных процессах.

Мы специально затронули этот сложный вопрос потому, что работы последних лет показали: практически любой люциферин и многие люциферазы имели «добиолюминесцентную» функцию защиты организма от АФК. Эти субстраты и ферменты продолжают выполнять такую функцию у ближайших несветящихся родичей биолюминесцентных организмов. Достаточно оказалось одной малой «поломки» исходной (окислительной) реакции, чтобы в ходе ее появилось хорошо заметное свечение. Возник новый признак – биолюминесценция. Его закрепил естественный отбор. Пока природой таких предполагаемых нами мутаций никто специально не занимался. Само их обнаружение – дело будущего.

Активируемые кальцием фотопротеины

Вернемся, однако, к экворее. В 1961–1962 гг. американские ученые Джонсон и Шимомура выделили из нее уже упомянутый белок экворин. Оказалось, он светится в присутствии свободного кальция и некоторых других двух- или трехвалентных катионов (но не магния, который это свечение ослабляет). Позже нашли такие же белки в колониальных гидроидных полипах Obelia longissima и O. geniculata, гребневиках, радиоляриях.

Во всех случаях оказалось, что светится комплекс люциферазы с перекисью предварительно присоединенного к ней и ею же окисленного люциферина (у всех вышеупомянутых организмов это целентеразин). В момент присоединения кальция к люциферазе пространственная структура (конформация) этого белка изменяется так, что он утрачивает связь с перекисью люциферина. Перекись при этом теряет стабильность и превращается в окисел, попутно отделяя СО2 и испуская синий свет:

Яркость такого свечения достаточно велика.В связи с тем, вскоре после выделения экворина родилась идея использовать этот белок и другие ему подобные (например, обелин) как индикаторы свободных ионов кальция во всевозможных клетках.

В 1967 г. английские ученые Эшли и Риджуэй с помощью стеклянного микроэлектрода впрыснули экворин в гигантское мышечное волокно морского желудя (сидячего морского ракообразного). Использованная установка позволяла одновременно регистрировать мембранный потенциал клетки, ее свечение, создаваемое впрыснутым экворином, и натяжение. Так обнаружили, что именно ионы кальция, цитоплазматическая концентрация которых повышается в 10 и более раз при электрическом раздражении клетки, запускают мышечное сокращение.

В дальнейшем сотни новых работ показали, что ионы кальция запускают самые разные клеточные процессы: мышечные и немышечные сокращения, выброс нейромедиаторов в синаптическую щель, всевозможные виды секреции и т.д. Были синтезированы новые флуоресцирующие индикаторы Са2+ и других ионов, проникающие, в отличие от светящихся белков, сквозь клеточную мембрану. Однако начало этой новой эре положили, несомненно, светящиеся белки экворин и обелин.
В дальнейшем гены экворина и обелина выделили и клонировали в кишечной палочке E. coli. Затем были созданы трансгены кукурузы, клеток млекопитающих в культуре и т.д., постоянно синтезирующие апопротеин (безлюцифериновую часть) экворина или обелина. Достаточно было добавить к таким организмам целентеразин, чтобы наблюдать в хроническом опыте за свечением, отражающим изменения концентрации кальция в цитоплазме.

Зеленый флуоресцирующий белок GFP

Еще Джонсон и Шимомура, выделяя экворин, отметили, что живая экворея светится зеленым светом с максимумом интенсивности при длине волны 508 нм. Между тем выделенный экворин излучает синий свет с максимумом при 465 нм. В чем причина?
Биолюминесцентные ткани медузы при солнечном свете, а также при искусственном освещении ультрафиолетом или синим светом, отсвечивают зеленым. Это вызвано тем, что в фотогенных тканях медузы кроме экворина присутствует другой белок. Возбуждаясь под действием синего или ультрафиолетового излучений, испускает зеленый свет. За это свойство белок назвали зеленым флуоресцирующим белком (GFP). Молекулярная масса GFP A.victoria 28 кДа. В нем 238 аминокислотных остатков.

Позже другие исследователи, Гастингс и Морин, нашли GFP у ряда светящихся представителей двух классов кишечнополостных животных – гидроидов (Aequorea, Obelia и др.) и кораллов (морское перо Renilla). Судя по флуоресценции фотогенных клеток, подобный белок может иметься и у гребневиков Bolinopsis.

При изучении GFP удалось обнаружить ряд совершенно уникальных свойств. Многое пока не поддается объяснению. Так, невозможно представить себе веревку, которая сама собой постепенно свивается в гордиев узел. Однако подобное происходит со многими белками после их синтеза на рибосомах. GFP в этом отношении побивает все рекорды.

Третичная структура его удивительно сложна. Это подобие бочки или клетки с одиннадцатью так называемыми бета-складками – завернутыми винтом вертикальными прутьями. «Дно» и «крышку» образуют альфа-спиральные участки того же самого белка. Внутри столь сложной конструкции, как попугай в клетке, заключена флюорофорная часть. Она образуется самой же полипептидной цепью в результате дегидрогенизации (отнятия двух атомов водорода) и окисления молекулярным кислородом остатка аминокислоты тирозина. Окисленный тирозин реагирует с другой аминокислотой в той же цепи – глицином. Вот и готова излучающая часть молекулы. Она способна поглощать «ультрафиолетовые» или «синие» фотоны и испускать в обмен фотоны с меньшей энергией, соответствующие сине-зеленому свету. Эффективность передачи энергии в такой системе (квантовый выход) поразительно высока – около 0,8. Иными словами, только 20% поглощенной GFP световой энергии теряется (переходит в тепло), а остальные 80% преобразуются в излучаемый видимый свет.

GFP A. victoria клонировали в 1992 г. и сразу же начали применять как генетическую метку, соединяя ген GFP воедино с генами других белков или вводя мРНК GFP во всевозможные клетки. Стало ясно, что таким способом можно сделать видимыми места и темп образования белков, кодируемых другими генами, прослеживать рост клеточных клонов, в т.ч. патогенных бактерий и раковых клеток, а также наблюдать за размножением в организме всевозможных вирусов. В числе этих последних могут быть ретровирусы, внедряющие свои ДНК в геном хозяина, как, например, это делают вирусы гепатита и ВИЧ. К 2002 г. общее число работ с применением GFP как генетического маркера превысило 9000.

Вскоре появилась необходимость обогатить палитру применяемых цветных маркеров, чтобы можно было в одном опыте метить более чем один ген. Попытки добиться этого эффекта посредством мутации гена GFP, пересаженного в E.coli, почти ничего не дали: от исходного типа были получены слабосветящиеся или мало отличающиеся от него по цвету флуоресценции мутанты. Прогресс в этом вопросе тормозило сложившееся убеждение, что все GFP-подобные белки обязательно встроены в биолюминесцентные системы как преобразователи синего света. Мысль о том, что они могут функционировать совсем в иных качествах, выполняя совершенно другие функции, и при этом вовсе не обязательно быть «зелеными» и «флуоресцирующими», долго никому не приходила в голову.

Осенью 1998 г. С.А. Лукьянов, руководитель исследовательской группы Института биоорганической химии РАН, обратился к одному из авторов этой статьи - Ю.А. Лабасу - с просьбой порекомендовать биолюминесцентный организм, в котором можно найти белок с необычным цветом флуоресценции.

Лабас, обдумывая эту задачу, обратил внимание на следующие обстоятельства. Классы кишечнополостных Hydrozoa и Anthozoa, у которых обнаружены GFP, разошлись еще в глубоком докембрии. Гребневики от общих с ними предков отделились и того ранее. Следовательно, весьма вероятно, что все эти организмы унаследовали GFP от общих небиолюминесцентных предков. В то же время крупные подвижные животные с хорошо развитым зрением - рыбы, головоногие моллюски, высшие раки (т.е. потенциальные враги, а значит, и эволюционный повод обретения биолюминесценции) - появились не раньше кембрийского периода.

Стало быть, у GFP-подобных белков, как и у других компонентов системы свечения (люциферинов, люцифераз и т.д.), могли быть какие-то добиолюминесцентные функции. Тогда почему бы им ни сохраниться и по сей день? В самом деле: у целого ряда несветящихся кораллов, живущих в морских аквариумах Московского зоопарка и у любителей, при освещении ультрафиолетом или голубым светом появляется яркая зеленая флуоресценция. На вид она очень похожа на флуоресценцию GFP эквореи. Разные исследователи полагали, что за флуоресценцию кораллов ответственны какие-то низкомолекулярные солнцезащитные “пигменты”. А вдруг это не так?

На эту мысль натолкнула яркая зеленая флуоресценция ряда несветящихся кораллов и актиний, почти такая же, как у фотогенных клеток биолюминесцентных видов. Особенно бросилась в глаза флуоресценция кончиков щупалец у тихоокеанской актинии Anemonia majano, жившей в домашнем морском аквариуме известного московского любителя А.О. Романько. У другой актинии из того же рода, A. sulcata, кончики щупалец были красные. Не связано ли это у анемоний с разными вариантами белковых молекул, близких по структуре GFP?

Сколь ни безумными казались эти мысли, мы начали поиск таких белков. Сначала выделили матричную РНК (мРНК) из ярко окрашенных участков тела шести разных видов мягких кораллов - в первую очередь из флуоресцирующих кончиков щупалец актинии А. majano. Потом сотрудники Лукьянова разнообразными молекулярно-биологическими манипуляциями получили из мРНК кодирующую ДНК (кДНК) и попробовали “выловить” из нее молекулы, сходные по нуклеотидной последовательности с геном зеленого белка эквореи. “Ловля” осуществлялась с помощью праймеров - синтезированных одноцепочечных кусочков этого гена, способных заякорить на себе комплементарную цепь ДНК. Для такой цели синтезировали участки в 20 - 25 нуклеотидов, интуитивно показавшиеся самыми консервативными в гене GFP A. victoria. «Пойманный» ген пересадили в геном кишечной палочки. И она заблистала ярким зеленым цветом!

Вскоре мы узнали от Романько, что в его морском аквариуме живет Ricordia yuma - удивительная дискосома (дисковидная актиния без щупалец), которая при синем освещении флуоресцирует ярким красно-оранжевым цветом (у других дискосом он сине-зеленый). Само собой разумеется, мы заподозрили, что и у этой дискосомы есть белок, подобный GFP. Далее дело пошло быстрее. Из гена GFP A. majano и прочих подобных генов легче было конструировать праймеры для новых вариантов.

Гены вновь открытых белков и GFP A. victoriа оказались гомологичными: последовательности их нуклеотидов совпадали на 20 - 30%. Значит, такой же гомологией характеризовались и сами белки. Весьма солидная степень совпадения, если учесть, что ветви кораллов и гидроидов разделились примерно полмиллиарда лет назад! Вероятность поймать праймером фрагмент гена с полным совпадением нуклеотидов при первой попытке М.В. Матца не превышала вероятность выигрыша в «Спортлото». Но - чудо. Иначе не скажешь. Одним словом, в самом начале охоты за генами белков, подобных зеленому флуоресцирующему, всем участникам сопутствовало фантастическое везение.

В дальнейшем работа стала почти рутинной. И вот ее сенсационный результат: за большинство флуоресцентных и даже обычных окрасок (а это все цвета радуги!) несветящихся видов кораллов и, возможно, других кишечнополостных ответственны вовсе не разнородные низкомолекулярные “пигменты” и их комплексы с белками, как полагали ранее, а своеобразные белки одного семейства с GFP. У них одинаковые или очень близкие молекулярная масса, число аминокислотных остатков (229 - 266) и, что куда важнее, их последовательность. Та же самая бочкообразная структура и, главное, сходным образом устроенный хромофор с участием Тир-66 и Гли-67. Только в 65-й позиции вместо серина, как у A. victoria, находятся другие аминокислоты: лизин, аспарагин или глютамин.

Только что имела место новая сенсация. Оказалось, что GFP-подобные белки, только на 17-21% совпадающие по своей нуклеотидной последовательности с такими белками гидроидов и кораллов, ответственны за ярко-зеленую флуоресценцию небиолюминесцентных морских веслоногих рачков из семейства Pontellidae. Происхождение этого белка у организмов, столь неродственных кишечнополостным, пока остается загадкой.

“Научная карьера” цветных белков

Открыв цветные белки, мы получили возможность наблюдать в одном и том же объекте биосинтетическую активность сразу нескольких разных генов, различаемую по цветам флуоресценции. Аналогично, удается наблюдать за развитием сразу нескольких клеточных клонов, вводя в них матричные РНК GFP-подобных белков разного цвета. Так, наш коллега А.Г. Зарайский инъецировал мРНК двух цветных белков в эмбрион шпорцевой лягушки на стадии восьми бластомеров: красного (от Ricordia yuma) - в левый спинной зачаток и зеленого (от A. majano) - в правый. Левая половина выросшего головастика стала красной, а правая - зеленой. Их разделяла желтая полоса посредине тела, где смешивались цветные клетки.

Со временем, возможно, удастся даже генетически красить в разные яркие цвета - флуоресцентные и нефлуоресцентные - декоративные растения, аквариумных рыбок (это уже удалось сотрудникам Сингапурского зоопарка) и, что куда важней, овец и пушных животных. И тогда, например, могут появиться овцы с наследуемой рубиновой, изумрудной или бирюзовой шерстью. Таким методом уже получены макака резус с зеленой шерстью и свинья с желтым флуоресцирующим пятачком. Много и других перспектив.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований. Проекты 02-04-49717 и 03-04-06653

Статья опубликована в кн.:
Российская наука: нам гранты думать и жить помогают.
Октопус. Природа, М.с.152-158.

.: Вернуться в документ Биолюминесценция в образовании :: Вернуться в меню Документов :.
 

Laboratory of Bacterial Bioluminescence © 2004-2013
This site is supported by a grant № 05-07-90157b from the Russian Foundation for Basic Researches
Insitute of Biophysics SB RAS

Яндекс цитирования